Genetics 72-155
Bioinformatics lab
ריצוף דנ"א
עד שנות ה-70 של המאה העשרים, בירור רצף
של מקטע דנ"א כלשהו היתה מטלה קשה עד מאד. את שלבי
העבודה היה צריך לעשות "בידיים" בצורה איטית ויסודית, בתהליך מייגע שפעל
על בסיס טיפולים כימיים, ביקוע הגדילים, והרצת מקטעים על ג'ל. לעומת זאת כיום
ריצוף דנ"א מתבצע בדרך קבע במכשירים אוטומטיים, בקצב של עד כ-1000 בסיסים
בשעה לכל ניסוי.
השיטה הנפוצה כיום לריצוף דנ"א פותחה
בעקרון ע"י סאנג'ר בשנת 1977. ביסוד השיטה עומדת ראקציית שכפול דנ"א בעזרת פריימרים
ספציפיים או לא-ספציפיים. בתוך תערובת הנוקלאוטידים
החופשיים שמשתתפים בתהליך נמצאים גם דידאוקסי-נוקלאוטידים, כלומר נוקלאוטידים
שהוסר מהם גם החמצן בפחמן '3. נוקלאוטיד כזה אינו מסוגל
להתחבר לנוקלאוטיד נוסף, ולכן שילובו בגדיל מביא להפסקת
ההארכה.
באופן זה נוצרים בראקצייה
הזאת מקטעים באורכים שונים, כאשר כל אחד מסתיים בדידאוקסי-נוקלאוטיד כלשהו. הרצה של תוצרים על ג'ל הפרדה תניב סדרה של
פסים בכל הגדלים, מגודל הפריימר ועד גבול כושר ההארכה
של האנזים בראקצייה. את התוצרים מריצים על ג'ל בעל כושר
הפרדה של בסיס אחד; כך כל פס בג'ל מייצג גודל אחר של מקטע, והפרש הגודל של שני
פסים סמוכים הוא לרוב בסיס אחד בלבד.
הפיתוח הבא בשיטה הוא בהוספת קבוצה זוהרת (פלואורופור) לדידאוקסי-נוקלאוטידים, כאשר לכל בסיס מורכב צבע שונה. כך בג'ל ההפרדה
נקבל סדרה של פסים, כאשר צבע הפס מייצג את זהות הבסיס הדידאוקסי-
שבו, כלומר הבסיס האחרון. היות שיש פסים בכל הגדלים, וצבע כל פס מייצג את זהות
הבסיס האחרון במקטע, סדר הצבעים מהפס הקטן ועד לגדול נותן את הרצף המקטע. שיטה זו
תוארה לראשונה ע"י Prober וחבריו בשנת 87'.
הפיתוח האחרון בדרך לריצוף אוטומטי היה
בשנות התשעים, בניצול טכנולוגיית PCR לביצוע שכפול
הדנ"א בנוכחות הדידאוקסי-נוקלאוטידים.
כך התאפשר לבצע ריצוף אוטומטי, בו מכשיר PCR מבצע את הראקצייה על המקטע עם תערובת הנוקלאוטידים
והדידאוקסי-נוקלאוטידים,
מריץ את התוצרים על מצע מפריד, וסורק את הפסים. התוצאה היא קובץ ממוחשב של סדר
הצבעים והרצף המשתמע ממנו. כמובן, ייתכנו סטיות בריצת המקטעים ובסריקת המחשבים,
לכן יש צורך לעבור על הנתונים ולוודא את הרצף הסופי.